Paper: PLOS ONE, March 5, 2021, M. Di Stazio et al. (Link): Systematic analysis of factors that improve homologous direct repair (HDR) efficiency in CRISPR/Cas9 technique
Das CRIPR / CAS-System wird seit mehreren Jahren als Werkzeug für genetische Modifikationen eingesetzt. Die bakterielle Cas9-Nuklease erzeugt Doppelstrangbrüche in der DNA in einem sogenannten PAM (proto-spacer adjacent motifs), einem im Genom wiederholten Trinukleotid-Bereich. Mit Hilfe synthetischer RNA-Sequenzen (Guide RNA) kann die Region in der DNA gezielt verändert werden.
Die Doppelstrangbrüche werden durch die zelleigenen Reparaturmechanismen wie nicht-homologe Rekombinationsendverbindung (NHEJ) und homologe direkte Rekombination (HDR) repariert. NHEJ erzeugt zufällige Einfügungen oder Deletionen in der DNA und blockiert so die korrekte Proteinproduktion. HDR fügt DNA-Sequenzen in den richtigen Kontext ein, wobei Proteinproduktion oder Proteine gezielt verändert werden können. In diesem Fall ist die Änderungseffizienz durch Homolog Direct Repair (HDR) jedoch deutlich geringer als bei versehentlichem Einfügen und Löschen durch NHEJ.
Die Effizienz kann durch die Verwendung von zwei sgRNA erhöht werden. Der Zellzyklus wird in G2 / M gestoppt und es erfolgt eine Zugabe von ssODN (ss oligo Spender). Alle Optionen wurden auch in Kombination in dieser Publikation getestet.
The double-strand breaks are repaired by the cell's own repair mechanisms, such as non-homologous recombination end joining (NHEJ) and homologous direct recombination (HDR). NHEJ creates random insertions or deletions in the DNA, blocking correct protein production. HDR inserts DNA sequences in the right context, whereby protein production or proteins can be modified in a targeted manner. In this case, however, the modification efficiency through homolog direct repair (HDR) is significantly lower than in the case of accidental insertion and deletion through NHEJ. The efficiency can be increased by using two sgRNA, stopping the cell cycle in G2 / M and adding ssODN (ss oligo donor), all options are tested also in combination in this publication.
In dieser Publikation wurde die Effizienz der CRIPR /Cas9-Reaktion auf das TNFα -Gen untersucht. TNFα reguliert viele biologische Prozesse, kann Krankheiten wie rheumatoide Arthritis verursachen und ist auch an der Tumorentwicklung und -fortschreiten beteiligt.
Ein T7EI-Nuklease-Assay wurde zur Effizienzanalyse der Doppelstrangbrüche verwendet. Die HDR-Effizienz konnte durch Verdauen mit SmaI überprüft werden, da ein SmaI-Schneidebereich in die HDR integriert wurde. Für die Gelanalyse wurde die Agarose mit MIDORI Green Xtra gefärbt.
Dieser Farbstoff ist ein ultraempfindlicher nicht-krebserregender und ungiftiger Farbstoff, der perfekt für die Erkennung mit Blau -oder Blau/Grünem LED-Licht geeinet ist. Die Empfindlichkeit und Schärfe sind so gut wie bei Gelen, die mit krebserregendem EtBr gefärbt sind. Dies ermöglicht die Erkennung sehr klarer Banden, auch bei schwachen Signalen. Die HDR-Effizienz lässt sich sehr gut aus den MIDORI Green Xtra Gelen berechnen, da dieser Farbstoff für die Quantifizierung gut geeignet ist.